大鼠腦創(chuàng)傷后p53、Bax和Fas蛋白的表達與神經(jīng)細胞凋亡對學習記憶功能影響的實驗研究

摘  要

　　　目的：在分子生物學水平，進一步深入研究顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞延遲性死亡的機制，探討美洛寧對大鼠腦創(chuàng)傷后學習記憶功能的影響，為臨床**顱腦創(chuàng)傷病人提供一定的理論基礎。大鼠腦創(chuàng)傷后對學習記憶功能影響的實驗研究
　　　材料與方法：1、采用Marmarou 1994年創(chuàng)立的方法建立大鼠重型閉合性顱腦創(chuàng)傷模型。2、將Wistar大鼠300只隨機分為腦創(chuàng)傷組（96只）、美洛寧**組（96只）、假手術組（96只），每組又分別劃分成傷后3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、168小時及336小時等8個時相組，另取12只作為正常對照組。3、給**法：美洛寧**組經(jīng)致傷后，給予腹腔注射美洛寧（30mg/kg/天），直至各時相點處死；腦創(chuàng)傷組、假手術組及正常對照組在相同時間給予等量的生理鹽水腹腔注射作為對照。4、另取48只大鼠隨機分為腦創(chuàng)傷組（12只）、美洛寧**組（12只）、假手術組（12只）及正常對照組（12只），進行水迷宮測試。5、采用HE染色、**組織化學、原位細胞凋亡檢測及Morris水迷宮等方法，動態(tài)觀察大鼠顱腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)的組織病理改變，p53、Bax和Fas蛋白的表達情況以及空間學習記憶的改變。6、通過比較傷后各組相同時相點海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡、p53、Bax和Fas蛋白表達以及學習記憶功能的變化特征，探討美洛寧對大鼠傷后學習記憶功能障礙的影響。
　　　結果：1、重型閉合性顱腦創(chuàng)傷后海馬CA2-3區(qū)于傷后72小時可觀察到廣泛的神經(jīng)元變性、壞死。，隨后該病理趨勢逐漸減緩。2、凋亡陽性細胞在傷后24小時開始出現(xiàn)，隨時間延長數(shù)量逐漸增多，傷后7天達高峰隨后數(shù)量開始下降。凋亡陽性細胞主要位于海馬CA2-3區(qū)及齒狀回。假手術組各時相點及正常對照組海馬CA2-3區(qū)未檢測出凋亡陽性細胞。3、大鼠傷后3小時海馬CA2-3區(qū)出現(xiàn)P53蛋白表達。12小時明顯增強，1-2天達高峰，3天即有所下降，于傷后7天已不能檢測到p53蛋白的**反應，鏡下觀察可見陽性細胞著棕黃色。。假手術組各時相點及正常對照組海馬CA2-3區(qū)未檢測出p53蛋白表達陽性細胞。4、大鼠傷后6小時海馬CA2-3區(qū)Bax蛋白的**反應增強，于2-3天達高峰，傷后7天明顯下降，于14天恢復至正常水平。正常對照組CA2-3區(qū)可見輕度的Bax蛋白的**反應，假手術組各時相點均與正常對照組無明顯差異。5、大鼠傷后6小時海馬CA2-3區(qū)出現(xiàn)Fas蛋白的表達增加，于12小時明顯增強，2-3天達高峰，7天明顯下降，于14天Fas蛋白**反應消失。假手術組各時相點及正常對照組海馬CA2-3區(qū)未檢測到Fas蛋白的表達。6、美洛寧**組傷后海馬神經(jīng)細胞P53、Bax及Fas蛋白表達高峰均較創(chuàng)傷組明顯下調(diào)。凋亡陽性細胞密度亦較創(chuàng)傷組有所下調(diào)。7、Morris水迷宮測試表明，傷后大鼠存在明顯的空間學習記憶障礙，于傷后9天及10天潛伏期明顯延長，搜索運動軌跡顯示：美洛寧**組、正常對照組及假手術組大鼠隨時間在搜索策略的改變上較腦創(chuàng)傷組更為理想。大鼠腦創(chuàng)傷后對學習記憶功能影響的實驗研究
　　　　結論：1、重型閉合性顱腦創(chuàng)傷后，海馬區(qū)神經(jīng)元存在有延遲性細胞死亡現(xiàn)象其形式不僅表現(xiàn)有壞死，也表現(xiàn)有細胞的凋亡。2、海馬區(qū)神經(jīng)細胞的延遲性死亡是造成大鼠傷后長期學習記憶功能障礙的主要因素之一。3、p53、Bax及Fas蛋白的表達上調(diào)可能參與調(diào)控了細胞凋亡的過程。4、美洛寧可能通過抑制p53蛋白、Fas蛋白及Bax蛋白的表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡。5、美洛寧可能通過抑制神經(jīng)細胞壞死凋亡、促進細胞修復及重塑信息環(huán)路對傷后學習記憶功能障礙發(fā)揮**作用。
　　　
　　　關鍵詞：重型閉合性顱腦損傷  海馬  神經(jīng)元  凋亡  p53  Bax  Fas  學習  記憶  Morris水迷宮  美洛寧
　　　
Experimental Research on the Effect of the  Expression of p53, Bax and Fas Proteins and  Neuronal Apoptosis on Cognitive function after Traumatic Brain Injury in Rats。
Abstract
        Objective: On the level of molecular biology, certain theoretical bases are provided for clinical therapy on the basis of deeply studying mechanism of delayed neuronal death after traumatic brain injury and probing into the influences of cognitive functions of CTP on rats after brain trauma.
　　　Materials and Methods: 1. The model of severe closed traumatic brain injury(TBI) was established according to the method created by Marmarou in 1994. 2. 300 Wistar rats were divided randomly into TBI group (n=96), CTP treating group (n=96) and fake operation group (n=96) and each of these three groups was divided into 8 subgroups, namely, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 168 and 336 hours. At the same time, the rest 12 rats were taked as the normal group for comparison. 3. Medication: The CTP treating group after injury were treated with CTP (30mg/kg/d) in peritoneum; TBI group, the fake operation group and the normal group were treated with Saline for comparison at the same time and all were killed at each time point. 4. Another 48 rats were divided randomly into 4 groups, namely, brain injury group, CTP treating group, fake operation group and the normal group, and their cognitive dysfuction was evaluated using the Morris water maze(MWM)5. Adopt such methods as H&E, immunohistochemistry, TUNEL stain and Morris water maze dynamically observe pathological changes in hippocampus of rats and the expressions of p53, Bax and Fas proteins and space learning and memorizing changes after brain injury. 6. Through comparing neuronal apoptosis in hippocampus of each group at the same time point after injury, the expressions of p53, Bax and Fas proteins and the change characteristics of learning and memorizing functions, the influences of CTP on learning and memorizing obstructions of rats after injury are probed into.
　　　Results: 1. At 72 hours postinjury, the comprehensive neuronal degeneration and necrosis could be observed  in the CA2-3 region of hippocampus. ,which tend to slow down as time went on.
　　　2. Apoptosis-positive cells began to occur at 24 hours postinjury and its number increased with the time went on and in 7days postinjury the number came to the maximum and then it began to decline. Apoptosis-positive cells lied mainly in the CA2-3 region and dentate gyrus of hippocampus. In the CA2-3 region of  hippocampus, apoptosis-positive cells were not detected in the fake operation group at every time point and the normal group .
　　　3. P53 protein expression appeared in the CA2-3  region of hippocampus in rats at 3 hours postinjury, strengthened obviously 12 hours later, reached maximum after a day or two, and declined 3 days later. After 7 days, the immune reaction of p53 proteins could not be detected, and positive cells were brown-yellow under microscope. In the CA2-3 region of hippocampus, positive cells were not detected in the fake operation group at every time point and in the normal group.
　　　4. Immune reaction of Bax proteins strengthened in the region of CA2-3 in hippocampus in rats at 6 hours postinjury, reached maximum after 2 days or three, declined obviously 7 days later, and restored to the normal level on the 14th day. Slight immune reactions of Bax proteins could be observed in the Ca2-3 region of hippocampus of the normal group, while no obvious difference existed between the fake operation group at every time point and the normal group.
　　　5. Fas protein expression strengthened in the CA2-3 region of hippocampus in rats at 6 hours postinjury, which became obvious 12 hours later, reached maximum after two days or three, and declined obviously 7 days later. Immune reactions of Fas proteins disappeared on the 14th day. Fas protein expression could not be detected in the C2-3 region of hippocampus in the fake operation group at every time point and in the normal group.
　　　6. In comparison with TBI group, the apex of the expressions of P53, Bax and Fas proteins of neurons in hippocampus of CTP treating group declined obviously and apoptosis-positive cells also declined.
　　7. Morris water maze tests showed that obvious space learning and memorizing obstruction existed in rats after injury, delitescence prolonged obviously 9 to 10 days later. Search moving tracks shows that search strategy altered more ideally with time in the normal group and fake operation group than in TBI group.
　　　　Conclusions: 1. After severe closed brain injury in rats, the phenomena of delayed cell death existed in the neurons in hippocampus, where neuronal necrosis and  apoptosis happen simultaneously.
　　　　2. Delayed death of nerve cells in hippocampus is one of the main causes of permanent learning and memorizing dysfunction in rats after injury.
　　　　3. The rising expressions of p53, Bax, and Fas proteins may participate in the regulation of the course of apoptosis after TBI .
　　　　4. CTP may suppress apoptosis of nerve cells after TBI through suppressing the expressions of p53, Fas, and Bax proteins.
　　　　5. CTP plays a important role in curing learning and memorizing obstruction after injury through suppressing necrosis and apoptosis of nerve cells, stimulating cell rehabilitation, and remolding information circulation route.
　　　
　　　Key Words: rats; severe closed traumatic brain injury; hippocampus; neuron; apoptosis; p53; Bax; Fas; cognitive; Morris water Maze; CTP

大鼠腦創(chuàng)傷后對學習記憶功能影響的實驗研究

前  言

　　　顱腦創(chuàng)傷及其后遺癥一直是危害人類健康的主要因素之一。其中顱腦創(chuàng)傷后學習記憶障礙對人類的影響*為普遍和持久[1][2]。學習記憶是人類賴以生存所不可缺少的重要的腦功能之一，皮質是調(diào)整學習過程的重要部位，海馬是記憶儲存的關鍵結構[3]。近年來，分子生物學研究發(fā)現(xiàn)，海馬作為腦損傷后選擇易損區(qū)，傷后出現(xiàn)神經(jīng)細胞延遲性死亡，從而出現(xiàn)長期學習記憶功能障礙。目前，國內(nèi)外有關這一領域的研究大多局限于缺血性腦損傷，而有關腦創(chuàng)傷后這一領域的確切機制尚無**的報導。因此，本研究利用Marmarou重型閉合性顱腦損傷模型，采用**組織化學、原位細胞凋亡檢測及國際上先進的Morris水迷宮技術對大鼠腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞凋亡以及學習記憶功能障礙的相關機制進行探討，同時應用美洛寧進行**，以期為臨床**顱腦創(chuàng)傷病人提供新的理論基礎和**途徑。
　　　
材料與方法

實驗材料
主要試劑：
 原位凋亡（TUNEL）試劑盒：由德國寶靈曼公司提供。
 P53、Bax、Fas**組織化學檢測試劑盒：由北京市中山生物技術有限公司提供。
 美洛寧（購自于廣東江門生物技術公司，**批號：粵衛(wèi)藥準字第616021號）
主要儀器設備：
TGL-16B高速離心機（上海）。
 404-3型隔水式電熱培養(yǎng)箱（江蘇）。
 CMIAS-真彩色醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)（北京）。
 OLYMPUS攝像顯微鏡（日本）。
 Leica石蠟切片機（德國）。
 MM-2型微量震蕩儀（江蘇）。
 上海欣軟信息科技有限公司研發(fā)的Xmaze動物行為分析系統(tǒng)可用于開展水迷宮實驗。
實驗動物：
健康雄性Wistar大鼠（購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心）348只，體重300g-350g。
實驗方法
實驗動物分組
 取300只大鼠隨機分成腦創(chuàng)傷組（96只）、假手術組（96只）及美洛寧**組（96只）。每組又分別劃分為傷后3、6、12、24、48、72、168、336小時等8個時相組，其中腦創(chuàng)傷組、美洛寧**組、假手術組每個時相點及正常對照組各12只大鼠。
 另取48只大鼠隨機分為腦創(chuàng)傷組、美洛寧**組、假手術組及正常對照組，每組各12只。大鼠腦創(chuàng)傷后對學習記憶功能影響的實驗研究
大鼠閉合型腦創(chuàng)傷模型制備
 大鼠于致傷前0.5小時，經(jīng)腹腔注射阿托品（30mg/kg/天）。
 以乙醚吸入方式麻醉動物至疼痛刺激反應消失。
 將麻醉后大鼠腹臥位固定于海綿床墊（10×10×20cm3）上，以75%酒精**術區(qū)后，沿中線矢狀切開頭皮約15mm，剝離骨膜，顯露冠狀縫及人字縫，將一不銹鋼墊（直徑8mm，厚2mm）固定在大鼠冠狀縫與人字縫之間。
 經(jīng)上述準備后，大鼠頭部固定于致傷架下；重450g，直徑18mm的銅棒沿垂直玻璃管2m高度自由落下致傷；即刻移開大鼠以免銅棒反彈造成頭部二次擊傷。
 致傷后，大鼠頭皮傷口常規(guī)**、縫合。
 假手術組僅給予麻醉及頭皮切開、縫合，但不致傷。正常對照組不做任何處理。
動物給**法
 美洛寧**組大鼠傷后經(jīng)腹腔注射美洛寧 1ml/次/只，每24小時1次直至各時相點處死。
 腦創(chuàng)傷組、假手術組及正常對照組在相同時間內(nèi)給予等量生理鹽水腹腔注射。
標本采集與制備
 于上述傷后各時相點，對動物進行乙醚吸入深度麻醉。
 開胸，4%多聚甲醛經(jīng)心灌流固定10分鐘后，斷頭取出腦組織，置于4%多聚甲醛后固定12-24小時（4℃）。
 取出固定液中腦組織標本，常規(guī)脫水、石蠟包埋。
 冠狀面連續(xù)切片，厚度約10μm，經(jīng)粘片劑處理過的載玻片撈片，置于60℃烤箱烘烤1小時后，按下述方法進行染色。
HE染色方法
2.5.1 選取腦組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯及100%、95%、80%、70%濃度酒精梯度脫蠟至水，用蒸餾水沖去殘存酒精成分。
2.5.2 明礬蘇木素染色8分鐘，自來水漂洗，去浮色（10秒鐘左右），以1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，自來水漂洗半小時。
 經(jīng)1%氨水溶液數(shù)秒后，自來水漂洗1次（10秒鐘左右）。
 0.5%伊紅溶液進行復染3分鐘，經(jīng)漂洗去除伊紅浮色。
 經(jīng)70%、80%、95%酒精梯度脫水后，轉入無水酒精脫水6分鐘，二甲苯透明5分鐘，中性樹膠封片。
原位細胞凋亡檢測（TUNEL）法
 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。
 切片滴加0.1%TritonX-100于4℃孵育5分鐘,PBS緩沖液洗5分鐘×3次。
 每張切片滴加TUNEL標記反應混合液50μL。置于濕盒中，37℃孵育1小時。
 PBS緩沖液洗5分鐘×3次。擦干組織切片后，每張切片滴加AP-轉化液50μL，置于濕盒中，37℃孵育30分鐘。
 PBS緩沖液洗5分鐘×3次。
 每張切片滴加BCIP/NBT顯色液20μL，室溫避光顯10-30分鐘，光鏡下觀察。
 鏡下顯色滿意后，PBS緩沖液洗2-3次終止顯色反應。
 經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片。
 鏡下觀察，凋亡陽性細胞的染色質為新月型或蠶豆狀濃染。
p53蛋白、Fas蛋白及Bax蛋白**組化檢測方法
 石蠟切片，常規(guī)脫臘至水。
 3%過氧化氫溶液室溫下孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘。
 抗原修復15分鐘（溫度為92-98℃，修復液為檸檬酸-檸檬酸鹽緩沖液，PH為6.0）。
 PBS沖洗，3分鐘×3次。
 滴加封閉用正常血清工作液50μL，室溫孵育10-15分鐘，傾去，勿洗。
 滴加一抗（稀釋度：p53為1:50，Bax及Fas均為1:100）工作液50μL/張，37℃孵育1-2小時或4℃過夜。
 PBS沖洗，3分鐘×3次。
 滴加生物素化二抗工作液50μL/張，37℃孵育5-10分鐘。
 PBS沖洗，3分鐘×3次。
 滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液50μL/張，37℃孵育15-20分鐘。
 PBS沖洗，3分鐘×3次。
 DAB顯色劑顯色15-20分鐘。
 鏡下顯色滿意后，自來水充分沖洗，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片。
圖象分析
采用CMIAS-真彩色醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)（由北京航空航天大學提供）和OLYMPUS攝像顯微鏡進行海馬區(qū)陽性細胞記數(shù)（個/400倍視野）及陽性細胞的平均光密度值（OD）的測定。
　2.11 Morris水迷宮測試
2.11.1 Morris水迷宮實驗是目前國內(nèi)外研究中廣泛應用的檢測空間學習記憶功能***、客觀的一種方法。正常對照組、假手術組、腦創(chuàng)傷組及美洛寧**組大鼠分別于傷后7、8、9、10天進行水迷宮測試。
 實驗時，將**島隨機置于水迷宮四個象限（N、S、E、W）中的任一象限，加水（奶粉沖呈乳白色）至高過**島10mm，水溫保持在22℃-25℃，由攝象機及計算機自動跟蹤、拍攝和統(tǒng)計大鼠分別由其他三個象限入水后尋找到**島的軌跡和潛伏值。如在180秒內(nèi)未找到**島，則潛伏期值記為180秒。
統(tǒng)計學方法
　　　實驗中所得數(shù)據(jù)均用X±S表示，經(jīng)access數(shù)據(jù)庫整理后應用美國SAS統(tǒng)計軟件6.12 TS 020 for windows，進行t檢驗或方差分析。以單側P≤0.05為差異在統(tǒng)計學上有顯著性意義，P≤0.01為差異在統(tǒng)計學上有非常顯著性意義。大鼠腦創(chuàng)傷后對學習記憶功能影響的實驗研究

結  果

1 閉合型顱腦創(chuàng)傷模型的復制
　　按照Marmarou方法建立模型[4]。本實驗中，大鼠致傷后多數(shù)出現(xiàn)有短暫呼吸停止，給予人工輔助呼吸后，自主呼吸多于30-40秒內(nèi)恢復（自主呼吸未恢復者，死亡）；傷后大鼠多表現(xiàn)有四肢劇烈抽搐，持續(xù)時間約15-30秒，隨后前肢呈去皮層屈曲狀態(tài)；大鼠傷后均呈昏迷狀態(tài)，多于10-20分鐘內(nèi)意識狀態(tài)恢復并復正。上述觀察結果與Marmarou所描述的模型傷后表現(xiàn)大致相符，說明我們復制的模型是成功的。
傷后海馬區(qū)HE染色組織病理結果：
　　傷后24小時，腦創(chuàng)傷組大鼠海馬區(qū)及齒狀回即出現(xiàn)散在變性壞死神經(jīng)元，鏡下可見神經(jīng)細胞胞體收縮，色粉紅，核皺縮濃染，細胞周圍出現(xiàn)空隙；傷后72小時，海馬CA2-3區(qū)可觀察到廣泛水腫及神經(jīng)元變性壞死改變，視野內(nèi)可見有核溶解及神經(jīng)元細胞空泡樣變，神經(jīng)元存活數(shù)目明顯減少，細胞間隙顯著增寬；傷后7及第14天，海馬CA1-4區(qū)上述病理趨勢有所緩解。美洛寧**組于傷后72小時海馬CA2-3區(qū)組織病理改變較創(chuàng)傷組有明顯改善（見Fig.1-2）。
傷后皮層和海馬區(qū)P53、Bax、Fas蛋白表達檢測結果：
大鼠傷后3小時海馬CA2-3區(qū)出現(xiàn)P53蛋白表達。12小時明顯增強，1-2天達高峰，3天即有所下降，于傷后7天已不能檢測到p53蛋白的**反應，鏡下觀察可見陽性細胞著棕黃色。于傷后1-2天美洛寧**組較創(chuàng)傷組p53蛋白的**反應明顯減輕（見Table 1、Fig.3-9）。假手術組各時相點及正常對照組海馬CA2-3區(qū)未檢測出表達陽性細胞。
Table 1：腦創(chuàng)傷組及美洛寧**組傷后海馬CA2-3區(qū)神經(jīng)細胞p53蛋白表達改變（OD值）
分 組 時      相 n
 6h 12h 24h 48h 72h 
創(chuàng)傷組 0.058±0.013 0.107±0.014 0.149±0.016 0.115±0.017 0.053±0.012 12
**組 0.052±0.011 0.083±0.016* 0.106±0.017** 0.085±0.018* 0.039±0.011* 12
* P﹤0.05  ** P﹤0.01

大鼠傷后6小時海馬CA2-3區(qū)Bax蛋白的**反應增強，2-3天達高峰，傷后7天明顯下降，于14天恢復至正常水平。于傷后2-3天美洛寧**組較創(chuàng)傷組的Bax蛋白的**反應明顯減輕（見Table 2、Fig.10-17）。正常對照組CA2-3區(qū)可見輕度的Bax蛋白**反應，假手術組各時相點均與正常對照組無明顯差異。大鼠腦創(chuàng)傷后對學習記憶功能影響的實驗研究
Table 2：腦創(chuàng)傷組及美洛寧**組傷后海馬CA2-3區(qū)神經(jīng)細胞Bax蛋白表達改變（OD值）
分 組 時      相 n
 6h 12h 24h 48h 72h 
創(chuàng)傷組 0.067±0.009 0.082±0.011 0.101±0.018 0.140±0.015 0.147±0.019 12
**組 0.052±0.008 0.068±0.012* 0.078±0.017* 0.111±0.018* 0.104±0.015** 12
* P﹤0.05  ** P﹤0.01  正常組的OD值為0.038±0.008
3.3  大鼠傷后6小時海馬CA2-3區(qū)出現(xiàn)Fas蛋白的表達增加，12小時明顯增強，2-3天達高峰，7天明顯下降，于傷后14天Fas蛋白**反應消失。傷后2-3天美洛寧**組較創(chuàng)傷組Fas蛋白的**反應明顯減輕見(Table 3、Fig.18-24)。假手術組各時相點及正常對照組海馬CA2-3區(qū)未檢測到Fas蛋白的表達。
Table 3：腦創(chuàng)傷組及美洛寧**組傷后海馬CA2-3區(qū)神經(jīng)細胞Fas蛋白表達改變（OD值）
分 組 時      相 n
 6h 12h 24h 48h 72h 
創(chuàng)傷組 0.127±0.015 0.171±0.025 0.232±0.028 0.255±0.023 0.247±0.025 12
**組 0.123±0.016 0.157±0.020 0.189±0.025* 0.179±0.025** 0.174±0.021** 12
* P﹤0.05  ** P﹤0.01 
  傷后海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡檢測結果：
　　　正常對照組及假手術組海馬未見凋亡陽性細胞。腦創(chuàng)傷組大鼠傷后24小時，海馬CA2-3區(qū)即出現(xiàn)少量凋亡陽性細胞，鏡下陽性細胞核著藍紫色；傷后72小時陽性細胞數(shù)量逐漸增多；于傷后7天達高峰；傷后14天凋亡陽性細胞數(shù)量有所下降。與美洛寧**組同時相點比較，傷后7天及14天差異性顯著（見Table 4、Fig.25-31 ）。
Table 4：腦創(chuàng)傷組及美洛寧**組傷后海馬CA2-3區(qū)神經(jīng)細凋亡改變動態(tài)觀察
分 組 時      相 n
 24h 48h 72h 168h 336h 
創(chuàng)傷組 18.00±3.408 21.18±3.750 24.45±3.067 29.18±4.67 15.26±3.350 12
**組 17.45±3.504 19.45±3.11 21.19±3.562* 21.00±4.64** 11.82±2.560* 12
單位：個/400倍視野    * P﹤0.05  ** P﹤0.01 
　  Morris水迷宮測試結果：
　　　為避免大鼠顱腦創(chuàng)傷后運動功能障礙對水迷宮測試結果的影響，各組分別于傷后7、8、9及第10天進行Morris水迷宮測試。結果表明，創(chuàng)傷組傷后第9天（P<0.01）及第10天（P<0.01）搜索**島潛伏期較正常組及假手術組明顯延長。美洛寧**組傷后第9天（P<0.01）及第10天（P<0.01）搜索**島潛伏期較創(chuàng)傷組明顯縮短（見Table 5、Fig.32-35）。
Table 5：腦創(chuàng)傷后各組Morris水迷宮測試潛伏期（單位：秒）
分 組 時    相 n
 7天 8天 9天 10天 
正常組 140.25±22.54 96.50±18.92 42.66±11.15 28.83±8.92 12
假手術組 144.25±16.13 96.91±22.05 41.15±12.23 28.67±9.45 12
創(chuàng)傷組 168.08±25.16* 128.5±27.17* 79.08±19.51** 57.06±19.08** 12
**組 150.58±21.46+ 99.41±21.04+ 50.83±15.69++ 30.25±9.28++ 12
* P<0.05vs正常組  ** P<0.01vs正常組
+ P<0.05vs創(chuàng)傷組  ++ P<0.01vs創(chuàng)傷組

討  論   大鼠腦創(chuàng)傷后對學習記憶功能影響的實驗研究

學習和記憶障礙是各種顱腦損傷病人傷后*為常見的腦功能障礙之一，病人主要表現(xiàn)為傷后短期的學習能力下降，長期的語言、視覺、辨認記憶功能障礙和記憶存儲障礙[5]。目前，臨床對該癥尚缺乏有效的**手段。近年來，海馬作為學習記憶的重要結構及腦損傷后的選擇性易損區(qū)得到國內(nèi)外學者的廣泛關注。研究發(fā)現(xiàn)：（1）海馬區(qū)是學習記憶形成環(huán)路中重要的功能解剖結構；（2）海馬信息通路主要由齒狀回、完整的海馬CA1-3區(qū)、大腦腳聯(lián)合及內(nèi)嗅區(qū)皮層組成；（3）信息通路中的信號由內(nèi)嗅區(qū)皮層向齒狀回門區(qū)、海馬CA3、CA1區(qū)及大腦腳聯(lián)合單向傳導，*后再由大腦腳聯(lián)合投射至內(nèi)嗅區(qū)皮層的特定部位完成整個環(huán)路[6]。以往在這方面的實驗研究多限于缺血性腦損傷模型，而有關其在顱腦創(chuàng)傷后學習記憶功能障礙中所起的作用尚無詳盡的報導。近年來，人們成功的創(chuàng)立了多種類型的顱腦創(chuàng)傷動物模型，從而為廣泛開展這一領域的研究奠定了基礎。諸多實驗證實，閉合性顱腦創(chuàng)傷動物模型可成功復制出與人類腦創(chuàng)傷后學習記憶功能障礙相一致的臨床特征，并具有簡單易行、穩(wěn)定性及重復性好等特點[7][8]。因此，本研究采用Marmarou等人創(chuàng)立的重型顱腦創(chuàng)傷模型，從分子生物學角度初步探討了創(chuàng)傷條件下海馬區(qū)病理改變的有關機制及其對學習記憶功能的影響。
一、顱腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡與學習記憶功能障礙
細胞凋亡是有核細胞在一定條件下通過啟動其自身內(nèi)部機制，主要是通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的自然死亡過程。目前認為細胞凋亡不僅在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及可塑性發(fā)揮重要作用，而且還與成熟神經(jīng)系統(tǒng)的病理狀態(tài)，如：腦缺血及低血糖等密切相關。Grant Sinson等[9]在液壓腦創(chuàng)傷模型中研究發(fā)現(xiàn)：腦創(chuàng)傷后24小時，皮層、海馬及隔區(qū)即可出現(xiàn)凋亡的神經(jīng)細胞。本研究應用TUNEL法對大鼠重型閉合性顱腦損傷模型進行凋亡細胞檢測，結果顯示，傷后海馬區(qū)存在著神經(jīng)細胞凋亡現(xiàn)象，凋亡陽性細胞于傷后24小時出現(xiàn)，7天達高峰，傷后14天明顯下降。同時，HE染色發(fā)現(xiàn)傷后72小時存在著廣泛的神經(jīng)元的變性壞死。這表明腦創(chuàng)傷后存在著神經(jīng)細胞延遲性死亡，不僅表現(xiàn)為壞死，也表現(xiàn)為凋亡。
Bonfoco 等[10]在體外皮層神經(jīng)細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，加入低濃度外源性NMDA可導致神經(jīng)細胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學病理改變，而高濃度則導致細胞壞死的發(fā)生，提示興奮性氨基酸毒性與細胞的壞死、凋亡密切相關。結合本實驗中海馬區(qū)神經(jīng)細胞壞死、凋亡的過程，我們認為：（1）腦創(chuàng)傷后早期興奮性氨基酸的過度釋放，依其不同濃度及持續(xù)時間，同時誘導了神經(jīng)細胞的壞死和凋亡，以細胞壞死為主要病理表現(xiàn)；（2）腦創(chuàng)傷后期，隨興奮性氨基酸濃度的下降，神經(jīng)細胞的延遲性死亡則以凋亡為主，但仍同時伴有細胞壞死的形態(tài)學病理改變，這可能與腦創(chuàng)傷后的繼發(fā)因素，如：細胞內(nèi)鈣離子超載有關。Fineman等[11]報道，細胞內(nèi)鈣離子的濃度于腦創(chuàng)傷后48小時達高峰值，這一結果也從側面肯定了我們的推測。
腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞主要存在三種死亡形式：物理損傷性死亡、興奮性毒性死亡及延遲性細胞死亡。其中，延遲性細胞死亡是導致長期腦功能障礙的主要因素。本實驗結果顯示，顱腦創(chuàng)傷后，大鼠海馬CA2-3區(qū)存在有神經(jīng)細胞凋亡現(xiàn)象，持續(xù)時間至傷后14天：同時，我們于傷后7-10天利用世界上先進的水迷宮技術對大鼠學習記憶能力進行了測試，發(fā)現(xiàn)傷后9及10天出現(xiàn)明顯的空間學習記憶障礙。據(jù)此，我們認為：腦創(chuàng)傷后作為學習記憶功能結構的海馬區(qū)域存在著神經(jīng)細胞延遲性丟失，影響了細胞間的信息單向傳遞及整合，導致了大鼠長期的學習記憶障礙。
二、海馬區(qū)神經(jīng)細胞p53蛋白表達與凋亡
　　　P53基因是一種重要的抑癌基因，正常的p53基因即野生型p53基因（wt-p53）與突變型p53基因（m-p53），均參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)，野生型p53對凋亡有促進作用，而突變型p53對凋亡有抑制作用。腦損傷可導致野生型p53蛋白的表達增加[12]，而突變型p53蛋白迄今為止，只在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)[13]。由于我們檢測到的p53蛋白主要位于損傷后出現(xiàn)細胞凋亡的位置，因此推測本實驗檢測到的p53蛋白為野生型p53蛋白。
　　　目前，分子生物學研究結果已初步了解p53介導細胞凋亡的過程 [14]。推測p53介導受損神經(jīng)細胞凋亡的幾個環(huán)節(jié)如下：⑴首先某種損傷因素（很可能是DNA的輕微損傷）誘導p53在轉錄和翻譯水平大量表達。⑵核內(nèi)p53 蛋白大量堆積，并與損傷DNA（通常為單鏈）結合，使p53由靜止狀態(tài)激活，發(fā)揮轉錄因子作用，調(diào)節(jié)相關基因表達，如：p21WAF表達產(chǎn)物可使細胞周期靜止于G1點，并影響細胞周期蛋白活性，使細胞生長和增殖受到抑制[15]，但這一點可能對神經(jīng)元作用不大。⑶p53 蛋白表達后選擇性地抑制c-myc基因的轉錄，使c-myc mRNA迅速下降，從而誘導細胞凋亡。⑷p53還可以增加bax、IGF、Fas等表達，而間接降低抑凋亡蛋白bcl-2的表達。⑸p53也可能直接下調(diào)bcl-2的表達，從而增加神經(jīng)元凋亡的易感性[16]。⑹p53 蛋白還可以通過與細胞內(nèi)其它蛋白形成復合物，如復制蛋白抗原（RPA）、轉錄因子復合物IIH（TFIIH）、修復因子（GADD-45）等，以參與DNA合成、復制、修復及損傷 [17]。
　　　Kaya等[12]利用CCI模型研究了wt-p53蛋白，p53反應蛋白及細胞循環(huán)蛋白（Cyclin D1）的表達，認為DNA的損傷誘導了wt-p53蛋白，該蛋白激活了一系列下位效應基因，這些效應基因產(chǎn)物參與了細胞循環(huán)停止、DNA修復及凋亡。Napieralski等[19]用原位雜交組織化學技術研究了大鼠一側液壓腦損傷后腫瘤抑制基因p53、細胞循環(huán)基因cyclin D1的mRNA表達的區(qū)域分布及時程。在假手術組的腦組織沒有或僅有極少量的p53mRNA的表達。在傷后6小時，p53mRNA主要被誘導于TBI易損區(qū)的細胞，如挫傷的皮質、丘腦的膝狀核的中部和側部的細胞以及海馬CA3區(qū)及門部的神經(jīng)元。p53mRNA的增長也在海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元，即那些對液壓腦損傷相對耐受的細胞中檢測到。認為p53參與了TBI后的分子反應。在本實驗中，我們對重型閉合性顱腦創(chuàng)傷傷后大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞p53蛋白的表達及凋亡情況進行了觀察。結果發(fā)現(xiàn)，傷后3小時海馬CA2-3區(qū)錐體細胞層即可檢測到p53蛋白的**反應，于12小時**反應明顯增強，此時p53蛋白主要定位于胞漿，于傷后1-2天p53蛋白表達達高峰，此時于胞核中亦出現(xiàn)明顯的P53蛋白的**反應，傷后3天開始下降。P53蛋白先于凋亡的高峰出現(xiàn)，且與神經(jīng)細胞凋亡的分布大致相符。以上結果表明，顱腦創(chuàng)傷能夠誘導p53蛋白表達，p53蛋白可能參與了調(diào)控傷后神經(jīng)細胞延遲性死亡的病生理過程。
三、海馬區(qū)神經(jīng)細胞Bax蛋白表達與凋亡
　　　Bax是Bcl-2家族中*具有促死亡特征的基因。Bax被表達并轉位于線粒體是對各種細胞死亡信號的反應[20]。促凋亡的Bcl-2家族成員能夠導致細胞色素C從線粒體中釋放到胞漿[21]，接著細胞色素C和apaf-1，即CED-4的等同物以及dATP相互作用[22]，這個被激活的復合物可以產(chǎn)生具有活性的caspase-9，caspase-9可以斷裂其他的caspase（包括pro-caspase-3），使之具有活性[23]，caspase-3和其它的caspases協(xié)調(diào)一致，通過對各種蛋白進行分解從而促使細胞死亡[24]。
　　　本研究顯示：大鼠傷后6小時海馬CA2-3區(qū)Bax蛋白的**反應增強，**反應主要定位于胞漿，胞核也可見到，呈彌漫或散在的棕黃色顆粒。于2-3天達高峰，傷后7天明顯下降，于14天恢復至正常水平。這和國內(nèi)的有些學者在液壓腦損傷模型中的研究基本相似[25]，只是時程較長，這可能與致傷方法和致傷程度不同。
　　　O'Dell等[26]研究發(fā)現(xiàn)，大腦皮質創(chuàng)傷性腦損傷后24小時bax mRNA表達增加。Lu等[27]在對大鼠閉合性腦損傷后**神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元凋亡的時程進行研究時發(fā)現(xiàn)，在傷后4小時Bax蛋白表達增高，并伴隨著Bcl-2表達下調(diào)，在傷后1天處死的大鼠發(fā)現(xiàn)不同數(shù)量的TUNEL陽性神經(jīng)細胞。認為Bcl-2和Bax的比例改變參與了閉合性腦損傷后**神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的凋亡。有人研究發(fā)現(xiàn)液壓腦損傷后早期Bcl-2和Bcl-x蛋白水平下降，損傷的后期Bax蛋白水平升高[25]。結合本實驗的結果，我們認為：（1）顱腦創(chuàng)傷誘導了Bax蛋白表達增加，改變了線粒體膜的通透性，導致細胞色素C的釋放，激活了caspases，促使細胞死亡。（2）Bax蛋白增加改變了與能夠抑制凋亡的Bcl-2及Bcl-x的比例，抑制了Bcl-2及Bcl-x蛋白對細胞的保護作用，間接的促進了細胞的死亡。
四、海馬區(qū)神經(jīng)細胞Fas蛋白表達與凋亡
　　　Fas蛋白屬于神經(jīng)生長因子受體（NGFR）/腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族成員，這一家族成員對細胞生存、分化及**反應調(diào)節(jié)發(fā)揮著廣泛的作用[28]。Fas蛋白在功能上與TNF-RI密切相關，因為兩者都擁有一個能夠傳遞細胞毒性/凋亡信號的死亡結構域[28]。FasL與Fas結合可促發(fā)一系列細胞內(nèi)事件，*終導致靶細胞的caspases激活，細胞死亡[29]。此外，F(xiàn)asL和Fas結合可導致死亡結構域與細胞漿適配蛋白FADD發(fā)生聯(lián)系，這接下來恢復了caspase-8的活性，促發(fā)一連串的凋亡事件?，F(xiàn)已經(jīng)在多種細胞類型中檢測到Fas抗原，包括B、T**細胞系、腸、胸腺、肝、卵巢及心臟，fas-fasL系統(tǒng)在保持**特權中發(fā)揮重要作用[30]。FasL在眼和睪丸中持續(xù)表達，有人報道在人、小鼠及大鼠的星形細胞中也有表達[31]。
　　　本實驗中，大鼠閉合性顱腦損傷傷后6小時海馬CA2-3區(qū)出現(xiàn)Fas蛋白的表達增加，于12小時明顯增強，2-3天達高峰，7天明顯下降，于14天Fas蛋白**反應消失。我們發(fā)現(xiàn)Fas蛋白的**反應不但定位于胞漿，而且在核區(qū)出現(xiàn)更加強烈的染色，腦損傷后Fas蛋白在胞核中強烈表達尚未見文獻報道，其作用機制還有待于進一步研究。
　　　有關腦損傷后Fas蛋白的表達情況國內(nèi)外鮮有人報道。Rosenbaum等[32]證實，大鼠局灶性腦缺血后缺血區(qū)的神經(jīng)元fas及fasl表達增加，說明fas介導的凋亡參與了腦缺血的病理生理學過程。Beer等[33]在研究大鼠實驗性TBI后Fas及Fasl的表達時程中發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷后15分鐘至72小時損傷部位同側皮質內(nèi)分別見到增強的Fas及Fasl的**反應。結合本研究結果，F(xiàn)as蛋白的**反應高峰先于凋亡的高峰出現(xiàn)，我們認為：Fas及Fasl參與了大鼠閉合性顱腦損傷后凋亡性神經(jīng)變性的病理學機制。
五、美洛寧對腦損傷后學習記憶障礙的影響
　　　美洛寧（三磷酸胞苷二鈉）為一種促神經(jīng)細胞修復和再生的**，具有保護細胞膜結構和血腦屏障，以及減輕毒性代謝物質對神經(jīng)細胞的損害作用。本實驗中，美洛寧**組于傷后9天（P﹤0.01）及第10天（P﹤0.01），Morris水迷宮測試潛伏期明顯低于創(chuàng)傷組，兩組比較有統(tǒng)計學意義，而于正常組相比無明顯差異。運動軌跡圖象分析顯示，正常對照組、假手術組及美洛寧**組大鼠傷后隨時間在搜索策略的改變上也較創(chuàng)傷組更為理想。同時，我們在研究中發(fā)現(xiàn)，美洛寧能夠明顯抑制海馬區(qū)細胞凋亡基因p53、Bax和Fas蛋白的表達，并且使該區(qū)凋亡細胞的高峰下調(diào)。
　　　三磷酸胞苷（CTP）作為參與磷脂、蛋白質及核酸代謝的有效成分，能夠**營養(yǎng)神經(jīng)細胞。國外有實驗研究已證實了CTP能減輕甚至逆轉多種原因所引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，如：中毒性、代謝性、創(chuàng)傷性及缺血性腦損傷等[34]。重型顱腦損傷可導致不同程度的顱內(nèi)壓增高、腦灌注壓降低、腦缺血、缺氧等。實驗證實，CTP**外傷引起的意識障礙等神經(jīng)功能紊亂，主要是通過其神經(jīng)營養(yǎng)作用來降低腦水腫。磷脂酰乙醇胺（腦磷脂）和磷脂酰膽堿（卵磷脂）是細胞膜的主要成分，CTP直接參與甘油磷脂與核酸的合成。研究表明，細胞內(nèi)磷酸乙醇胺胞苷?；D移酶（PECT）、磷酸膽堿胞苷?；D移酶（PCCT）的活性和磷酸酯合成率對CTP細胞濃度具有高度的依賴性。PECT對CTP的依賴性更大[35]。CTP通過多種途徑參與腦磷脂合成，在提高神經(jīng)細胞膜的合成率方面發(fā)揮重要作用[36]。
　　　綜上所述，我們認為美洛寧能夠有效的改善大鼠腦創(chuàng)傷后空間學習記憶障礙，其機制可能為：1、為傷后神經(jīng)細胞提供能量，減少由于缺血、缺氧而產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物對神經(jīng)細胞的損害；2、抑制了傷后凋亡相關基因，如p53、Bax及Fas蛋白的表達，減少傷后神經(jīng)細胞的延遲性死亡；3、為傷后神經(jīng)細胞提供營養(yǎng)，參與甘油磷脂及核酸的合成，保護細胞膜結構，促進神經(jīng)細胞的修復和再生，重建海馬信息環(huán)路。
　　　總之，顱腦創(chuàng)傷后存在學習記憶功能障礙，傷后神經(jīng)細胞凋亡是多種因素改變相互作用的結果。本研究中，我們討論了腦創(chuàng)傷后p53、Bax及Fas蛋白的表達、神經(jīng)細胞凋亡與學習記憶功能障礙之間的聯(lián)系，以及美洛寧對其的影響，而它們與其它因素之間的內(nèi)在聯(lián)系，尚需我們在分子生物學水平進一步探討，這將為臨床**顱腦損傷，特別是基因**的開展提供新的思路。
　　　
結  論
　　　
　　　本研究應用Marmarou閉合性顱腦創(chuàng)傷模型，采用HE染色、**組織化學、原位細胞凋亡檢測及Morris水迷宮技術對傷后大鼠海馬區(qū)p53蛋白、Bax蛋白和Fas蛋白的表達、神經(jīng)細胞壞死、凋亡以及與大鼠傷后空間學習記憶功能的關系進行了研究，探討了美洛寧對大鼠傷后學習記憶功能障礙的**作用，結論如下：
1 重型閉合性顱腦損傷后海馬區(qū)神經(jīng)元存在延遲性細胞死亡現(xiàn)象，其形式不僅表現(xiàn)為壞死，也表現(xiàn)有細胞的凋亡。
海馬區(qū)神經(jīng)細胞延遲性死亡是造成傷后長期學習記憶功能障礙的主要因素之一。
凋亡相關蛋白p53、Fas及Bax的表達改變可能參與調(diào)控了細胞凋亡的過程。
美洛寧可能通過抑制p53蛋白、Fas蛋白及Bax蛋白的表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡。
美洛寧可能通過抑制神經(jīng)細胞壞死凋亡、促進細胞修復及重塑信息環(huán)路對傷后學習記憶功能障礙發(fā)揮**作用。

大鼠腦創(chuàng)傷后對學習記憶功能影響的實驗研究